癌症是一种主要由基因组异常引起的疾病。不断出现的新型测序技术，帮助研究人员研究癌症基因组，以了解癌细胞的分子状态并揭示其不稳定性，如驱动突变或基因表达异常。
三代测序技术使我们能够识别包括复杂结构变异的癌症突变。现代测序技术正在迅速发展，使我们能够更轻松地识别每个癌症病例中的突变。许多研究机构，如国际癌症基因组联盟（the international cancer genome consortium，ICGC）[50]和癌症基因组图谱（the cancer genome atlas，TCGA）[51] ，对每种癌症亚型特有的基因组进行了测序、分析和报告。他们主要关注点突变，如SNV和小片段的插入缺失，因为二代测序技术通常用于点突变的检测，其他类型的基因组变异非常复杂。
对于最长只有几百个碱基读长的二代测序而言，检测和精确识别各种大小的结构变异（Structural variant，SV）和重复区域中的突变是一项艰难的挑战。尽管已经开发了许多生物信息学工具和分析流程（如Pindel、DELLY2、Manta、SvABA），但检测准确度和精确度仍然有限。二代测序也缺乏每个等位基因的信息，这意味着我们错过了发生突变的等位基因。为了弥补二代测序的不足，长读长的三代测序技术应运而生。 近年来，许多三代测序技术得到了开发和应用。如单分子实时测序 （single molecule real time，SMRT） 是太平洋生物科学公司 （pacific biosciences，PacBio）开发的长读长测序方法之一，该方法基于连接在零模波导中的DNA聚合酶，检测荧光信号。
使用SMRT测序，可以获得超过10 kb的长读长数据。在最近的一份报告中，大约50%的序列以≥10kb的长度进行测序，这些数据用于构建人类基因组中常见SV的综合数据库[52]。Nanopore 测序仪已由Oxford Nanopore Technologies公司商业化。
蛋白质纳米孔排列在膜上，以检测DNA或RNA分子通过纳米孔时电流的变化，从而允许对分子进行直接测序。MinION是一种便携式三代测序平台，初始成本低，每次运行可获得>5Gb的数据。文库制备也很容易进行，每次测序只需约48小时。
此外，更大的平台GridIon和PromethION可以实现约10倍于MinION的数据输出。Jain等[53]报道了一种用于生成超长读长（高达>800kb）以对人类基因组进行测序和组装的流程，目的是检测包括重复序列和复杂结构变化的区域。这些长读长序列可用于探测短读长测序仪无法检测的基因组区域，突出了三代测序的优势。
三代测序现在变得越来越普遍，因此，使用三代测序的癌症研究迅速增加并不断取得进展，以破译复杂的癌症基因组。在这里，我们介绍了近期三代测序的癌症研究以及三代测序带来的癌症基因组学的新发现。
（作者：卓钟灵 戴二黑 赵晓涛）
01 三代测序在癌症基因组中的研究
三代测序的优势在于其适用于阐明等位基因突变状态和复杂癌症基因组的完整结构。虽然PacBio和Oxford Nanopore等具有代表性的长读长平台产生的序列碱基质量值低于Illumina等短读长测序平台，但在对大的基因组变异如CNV和SV进行基因分型时可以忽略这一缺点。这种方法已经用于各种疾病的治疗，包括多种癌症。此外，通过单独应用三代测序或与更准确的二代测序相结合，可以对单碱基水平分辨率变异 （如SNV和小片段插入缺失） 进行基因分型，如使用MinION测序来检测癌症相关基因 （如EGFR、KRAS、NRAS和NF1） 中的SNV和小片段插入缺失 [54] 。 三代测序的优势之一是以单等位基因分辨率鉴定基因组突变,如H1975肺腺癌细胞系中的EGFR原发性和继发性突变（分别为L858R和T790M）可通过三代测序进行分型[54-55]。在MinION序列中，研究者发现L858R和T790M突变都位于同一个等位基因中（72%的转录序列），另一个等位基因是野生型（22%的序列；其余6%的序列包括测序错误或次要等位基因部分）[54] 。
三代测序可能正在成为基因分型的新标准，为抗癌药物的使用提供证据，并为每个人量身定制正确的治疗方案。
此外，分型对于理解非编码突变的功能至关重要。在癌细胞中，启动子和增强子中存在许多突变，其中部分突变会导致异常转录，从而影响基因表达的水平。在癌细胞系中，仅TERT突变基因表达，这表明启动子突变产生了一个转录因子的结合位点并激活了突变等位基因中的转录和表达[56] 。
使用二代测序数据无法实现启动子与下游外显子区域在等位基因水平的直接关联，因为这些基因座相距数百个碱基，无法由单个或少量短读长序列覆盖。在之前的一
发布时间：2022-06-17 20:01
