Science:CAR-T+RNA疫苗，实体瘤终于被拿下！

自诞生以来，卡介苗疗法在血液肿瘤的治疗中取得了巨大的成功。在这种疗法中，从病人体内分离出免疫T细胞，然后通过基因编辑给它们安装一个名为“CAR”的导航器。后者将允许免疫细胞更准确地识别并攻击癌细胞。

然而，在实体肿瘤的应用中，这种治疗一直面临着各种瓶颈。挑战之一是缺乏免疫细胞识别实体肿瘤的“导航地址”。导航地址模糊，无法自然找到癌细胞，导致立体肿瘤治疗中卡介苗疗法效果有限。

最近，在《科学》杂志发表的一篇文章中，研究人员终于找到了这种独特的癌细胞CLDN 6号的“导航地址”，这是一种在细胞表面表达的蛋白质，能够将细胞紧密连接在一起。此外，为了增强对癌细胞的诱导和大量扩增T细胞，研究人员还设计了一种纳米颗粒核糖核酸疫苗(旨在将癌抗原转移到全身淋巴腔)，以进一步提高抗癌效果。

以下是《科学》原始部分的摘录:

为了评估CLDN6作为CAR-T细胞治疗靶点的适用性，研究人员分析了其在人和小鼠组织中的表达。在小鼠中，发现CLDN6是一种调节蛋白。通过免疫组织化学(IHC)染色，研究人员发现CLDN6在胎儿器官中广泛表达，但在出生前被下调，导致在成年小鼠的大多数器官中缺乏表达。在人类中，来自胃、胰腺、肺和肾的胎儿组织中的CLDN6的转录水平非常高，但是在相应的成人组织样品中没有检测到。研究人员分析了来自健康成人的50多种不同的组织类型，发现没有一种具有CLDN6。然而，IHC染色显示CLDN6蛋白在各种人类实体癌中表达，例如睾丸癌、卵巢癌、子宫癌和肺腺癌。

这些发现表明，在严格意义上，CLDN6是癌胚细胞表面抗原，并具有理想的CAR-T细胞靶向表达谱。

CLDN6目标验证

本研究设计了具有4-1BB共刺激信号域的第二代CLDN6-CAR。对于受体结构域，研究人员设计了一个单链可变区片段，以高特异性结合到CLDN6。首先，他们在体外鉴定了CLDN6-CAR工程人类T细胞。用增加量的CLDN6RNA转染人肺癌细胞，并评价它们是否被CAR-T细胞杀死。研究人员观察到，CLDN6-CAR对用CLDN6转染的细胞具有很强的识别和裂解能力(图1 C，D)。

在相同类型的实验中，研究人员还评估了CLDN-CAR对CLDN3、CLDN4、CLDN9和其他Caldin家族成员的交叉识别，并发现只有被CLDN6转染的靶细胞被杀死，而被其他claudins转染的靶细胞没有被杀死，表明CLDN6-CAR-T细胞的精确靶向性(图1E)。

为了检测同源免疫激活，研究人员将CLDN6-CAR-T细胞与人类肿瘤细胞系共培养。发现与CLDN6阳性靶细胞共培养时，T细胞活化标记物γ-干扰素(IFN-γ)有分泌和上调，而CLDN6阴性细胞没有。CLDN6-CAR-T细胞可有效去除CLDN6阳性的PA-1卵巢癌细胞球，并在再次刺激时将其反复杀死。CLDN6被CRISPR/Cas9敲除后，CAR-T细胞不能识别PA1，进一步证实了CLDN6-CAR-T细胞的高效率和特异性(图1G)。

其次，他们在小鼠皮下移植人肿瘤细胞系后，研究了人CLDN6-CAR-T细胞的体内抗肿瘤活性。值得注意的是，小鼠不适合研究这种CAR的毒性，因为CLDN-CAR和小鼠CLDN6之间的同源性结合亲和力比人CLDN6低15倍。此外，该研究还发现人CLND6仅在胚胎期表达，而小鼠CLND 6也在一些胚胎后发育细胞组织中表达。用单剂量的人CLDN6-CAR-T细胞处理具有OV90人卵巢癌细胞的NSG小鼠。结果显示，与癌症进展迅速的对照组相比，用CLDN6-CAR-T细胞处理的所有小鼠在2周内具有完全的肿瘤消退。在治疗后25天的整个观察期内，可以在治愈的小鼠中检测到循环的CLDN6-CAR-T细胞(图1H)。

众所周知，CAR-T细胞移植的存活率和持久性对其临床效果至关重要。在血液肿瘤中，卡氏T细胞直接作用于B细胞的髓样抗原并靶向宿主B细胞。作为抗原提呈细胞(APCs)，它们提供强增殖信号并促进CAR-T细胞的持久性。

然而，在实体肿瘤环境中，由于在实体病变中接触肿瘤细胞的CAR-T细胞的可及性受损，以及当CAR-T细胞在免疫抑制肿瘤微环境中达到目标时缺乏增殖信号，所以CAR-T细胞的频率通常迅速降低。研究人员假设在淋巴组织的树突状细胞表面上以其自然构象表达的CAR靶将使其能够在最佳免疫激活环境中刺激同源的CAR-T细胞。

核糖核酸疫苗祝福

在这项研究中，作者介绍了一种静脉注射脂质体抗原编码的核糖核酸(核糖核酸-LPX)，以刺激患者肿瘤相关的T细胞。该纳米颗粒疫苗将抗原转移至脾、淋巴结和骨髓中的APCs，同时启动Toll样受体依赖型I型干扰素驱动的免疫刺激程序，以促进抗原特异性T细胞的启动和强扩增。

为了测试这种方法是否可以作为核糖核酸疫苗来扩增卡氏T细胞(以下简称卡氏T细胞)，研究人员进行了一系列的实验。首先，他们测试了CLDN6是否能在体外刺激树突状细胞上的CLDN6-CAR-T细胞。根据编码核糖核酸-LPX的脱氧核糖核酸6(脱氧核糖核酸6-LPX)的浓度梯度实验，研究人员测量了脱氧核糖核酸6在树突状细胞上的浓度表达。由此得出结论，树突状细胞上CLDN6的表达以剂量依赖的方式诱导共培养的CLDN6CAR-T细胞的刺激、细胞因子分泌和增殖。在BALB/c小鼠静脉注射CLDN6LPX后，研究人员检测到CLDN6在脾脏树突状细胞和巨噬细胞上的表达，但在淋巴细胞上没有，这证明CAR抗原仅在体内转移到APCs。此外，注射核糖核酸-LPX的小鼠脾脏和淋巴结中也检测到强活化的自然杀伤细胞、B细胞和T细胞。

为了验证CARVac在实体肿瘤中的普遍性，研究人员选择了claudin家族中与癌症相关的成员CLDN 18.2在胃食道癌和胰腺癌中表达。研究人员设计了一种CLDN18.2-CAR，用抗LDN18.2单链抗体代替CLDN6特异性单链抗体。CLDN18.2CAR-T细胞具有与CLDN6-CAR相似的功能特征，包括抗原特异性激活和体外杀伤肿瘤细胞。与用CLDN18.2-LPX处理的树突状细胞共培养的CLDN18.2-CAR-T细胞也显示同源活化和增殖。事实证明，核酸疫苗可以成功地用于增强靶向CLDN18.2的CAR-T细胞的治疗效果

接下来，研究人员在一系列的老鼠实验中研究了卡瓦克的体内表现。

通过全身照射(TBI)对Thy1.2+C57BL/6小鼠进行淋巴清除，然后植入同源Thy1.1+CLDN6-CAR-T细胞以共表达Luc和GFP，随后接种CLDN6LPX。体内成像结果显示，单次静脉注射CLDN6-LPX诱导循环CLDN6-CAR-T细胞显著扩增。这种扩增与核糖核酸-LPX的剂量水平有关，甚至在最低剂量为0.625微克核糖核酸-LPX时也是显著的。此外，对小鼠外周血T细胞的定量和表型分析显示，Thy1.1+CAR-T细胞显示出激活表型的频率增加(KLRG1hi，CD62Llow)，而内源性T细胞在任何剂量的核糖核酸-LPX处理后不受影响。在用核糖核酸-LPX接种后3-4天，CAR-T细胞的数量达到高峰，然后开始下降(图2 A，B)。

在另一个实验中，几组小鼠接受初始剂量为103细胞/动物的CLDN6-CAR-T细胞，然后每组小鼠用以前的单一药物疗法或CLDN6-CAR-T细胞+CLDN6-LPX方案治疗。结果显示，在未接受CLDN6-LPX的小鼠中，原代CAR-T细胞的存活率与过继转移细胞的数量呈线性关系，并保持稳定或随时间缓慢下降。值得注意的是，在用CARVac处理的小鼠中，CAR-T细胞无论初始剂量如何都会扩增。正如Ki67在大多数转移的T细胞上的瞬时上调所表明的，几乎所有的CLDN6-CAR-T细胞群都被核糖核酸-LPX激活和增殖，并且被核糖核酸-LPX扩增的CLDN6-CAR-T细胞是功能完整的。与从未接种的小鼠分离的CAR-T细胞相比，当在体外与CLDN6阳性肿瘤细胞共培养时，它们产生更高水平的IFNγ，并显示更高的抗原依赖性细胞溶解活性(图2C)。

持久性、CRS和t细胞耗竭

为了评估重复接种核糖核酸-LPX疫苗对卡介苗-T细胞持久性的影响，cldn 6-卡介苗-T细胞移植小鼠接受了三周剂量的核糖核酸-LPX，然后在没有治疗间隔(4周和4.5周)的情况下接受了两次以上的核糖核酸-LPX。数据显示，在第一次接触CLDN6LPX后，CAR-T细胞迅速扩增了两个数量级，随后的每周治疗使CAR-T细胞保持在高水平。对于CLDN6-LPX治疗间隔延长至35天的治疗组，CAR-T细胞扩增减少。在未接种的小鼠中，CAR-T细胞的数量没有下降到植入量的基线水平，但是稳定在超过10倍的频率。在每个治疗间隔后，CLDN6-LPX可以稳定地扩增CLDN6-CAR-T细胞，表明CAR-T细胞的记忆形成。

细胞因子释放综合征(CRS)是抗逆转录病毒治疗中最突出的急性不良反应。为了探索CARVac策略增加全身性细胞因子释放的可能性，研究人员分析了轻度预处理的CLDN6-CAR-T细胞移植小鼠暴露于CLDN6-LPX后血清中IFNγ、IL6和TNFα的浓度。结果表明，只有γ-干扰素值在早期表现出轻微和短暂的增加。此外，经处理的小鼠外观正常，体重随时间有规律地增加。

因为重复使用核糖核酸-LPX和细胞毒性细胞效应器的强扩增可能会导致淋巴组织中的杀伤细胞减少，研究人员分析了LPX辐射暴露水平最高的小鼠的脾脏。然后得出结论，脾脏暴露于单剂量或重复剂量的核糖核酸-LPX没有显示任何明显的病理变化。重复RNA-LPX处理后，用流式细胞仪检测不同时间点脾细胞的组成。发现CD11c+DC和F4/80+巨噬细胞的数量略有下降，而T细胞、B细胞和NK细胞的数量无明显变化。从相应的时间点开始，脾脏组织切片中APC亚群的细胞分布没有改变。

最后，作者研究了核糖核酸-LPX在治疗荷瘤小鼠时对细胞的影响。在将亚治疗剂量的CLDN6-CART细胞注射到患有CLDN6LL/2-LLc1Lewis肺癌淋巴衰竭的C57BL/6小鼠中后，一次注射CLDN6-LPX或对照。分析表明，单独的CLDN6-CAR-T细胞疗法不能完全控制肿瘤，并且肿瘤不会消退，而只能延缓肿瘤的生长。相比之下，在接受CAR-T细胞+CLDN 6-LPX疫苗的10只小鼠中，6只小鼠的大肿瘤完全得到控制，它们的中位生存时间显著增加。研究者随后在用cldn18.2-lpx+cldn18.2 CAR-T细胞治疗的CT26结肠癌小鼠中复制了该结果，进一步支持了CARVac对CAR-T细胞的抗肿瘤作用(图3a和b)。

之后，研究人员在卵巢癌异种移植小鼠模型中测试了CLDN6-LPX对人CLDN6-CAR+T细胞的影响。结果显示，疫苗与亚治疗剂量(105个/只动物)的人CAR-T细胞联合使用完全抑制晚期肿瘤，而用人CAR-T细胞的单一药物治疗的小鼠肿瘤进展迅速(图4D)。像CLND 6-CAR-T细胞一样，人CLND 18.2-CAR-T细胞和CLDN18.2LPX在小鼠异种移植模型中再次证实了这些发现。

总之，这项研究得出了两个关键发现。首先，作者揭示了CLDN6作为实体瘤的CAR-T治疗的理想靶点的潜力。其次，重组人血管活性物质可以作为一种提高抗人肿瘤细胞抗肿瘤作用的方法。这些数据证实了在抗原识别后，在细胞因子反应和细胞溶解活性方面，核糖核酸-LPX刺激的细胞因子受体T细胞优于未刺激的细胞因子受体T细胞。它们形成记忆性T细胞，并以更高的频率存在。CARVac不仅能提高移植细胞的存活率，而且能在较低剂量下控制肿瘤的治疗。

参考资料:k. reinhard等. anrnavaine驱动claudin-car-tcells的扩增和对抗实体瘤的效率. science，doi: 10.1126/science.aay5967